垂直显像SMI

石鑫华视觉

石鑫华机器视觉网：垂直显像SMI是1996年在SMI与SPDM的基础上开发出来的，能在纳米等级上最快分析完整的3D细胞结构的光学显微镜，有效的纳米级光学分辨率，在解析2D图像能达到5 nm，而在解析3D图像能达到40 nm，所以比起以Abbe定律所算出来的物理极限200 nm还要更佳。Abbe在1873年提出理论上光学显微镜的分辨率限制假说。

垂直显像SMI光学显微镜是由海德堡大学光学应用与资讯处理博士克里斯托夫克勒梅所开发出来，集结了定位光学显微镜(光学间距精密显微镜SPDM, Spectral Precision Distance Microscopy)结构照明设备(空间调整照明设备SMI, Spatially Modulated Illumination)的科技。

自从2008年3月起，许多标准的荧光染剂像是GFP与Alexa荧光染剂可以应用在SPDMphymod (可物理修饰荧光团physically modifiable fluorophores)定位光学显微镜上，这种显微镜只有单一雷射波长才有适合的光强度能用在纳米图解上。

                               
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使用3D双重颜色超解析显微镜侦测乳癌细胞中的Her2与Her3，使用的标准染剂: Alexa 488, Alexa 568 - LIMON (SPDM +SMI)

配置

SMI是特别的雷射光学照明设备 (空间调整照明设备Spatially Modulated Illumination)与用Vertico反射垂直向的光，使之能够分析固定住的标本细胞也能分析光学分辨率在10纳米甚致更少的活细胞 (1纳米 = 1 nm = 1 × 10−9 m).

此项科技的特别之处与聚焦科技，例如4Pi光学显微镜相比，差在较宽视野能让整个细胞能在纳米等级的分辨率下完整的描绘出来。这种整个细胞的3D显像技术在20 µm × 20 µm的范围下，只需花2分钟，宽视野的显像能让整个物体的照明与针测同时进行。

空间调整照明设备(SMI: Spatially Modulated Illumination)

SMI 光学显微镜是建立在点分散函数工程的光学处理技术之上，用以修正显微镜的点分散函数(PSF) 来增加光学分辨率，使之能以波长等级来测量荧光物质的间距，分析其他结构参数则能达到纳米等级。

SMI显微镜在海德堡大学已经达到下列成果: 每个物件照明的强度都不一样，与传统的宽视野荧光显微镜不同，而是以两个相反方向的干涉雷射光来调整空间的精确性，这种空间上的调整波长原理是在1993 由Bailey et al发表。

SMI可以与其他超解析科技结合，像是与3D LIMON或是LSI-TIRF侧向显像技术而成全向内部显像。SMI 科技能允许读出自动荧光基团(autofluorophore)分布在人类眼睛组织的光学图像，这使用了3种不同激发波长(488、568 、647 nm)而能收集自动荧光发出的光谱讯号，这项技术已经应用在人类眼睛组织的斑点恶化上。

                               
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由SMI + TIRF来看人类眼睛组织的斑点恶化

定位显微镜(SPDM: Localization Microscopy)

SPDM (光学间距精密显微镜Spectral Precision Distance Microscopy)，定位光学显微镜的基础是荧光显微镜加上光学处理使得能测量"光学上分离"粒子的位置、距离与角度(例如:分子)光学显微镜的解析限制之下。 "光学上分离"指的是在一定的时间之内的一点上, 只有单一粒子或是分子在特定的区域被传统的光学分辨率下(大概是直径200-250 nm)侦测到。当所有的分子在某个区域都含有不同的光学标记就能实现(例如:不同的颜色或者不同粒子发射的不同激发光 )。

使用SPDM能达到结构的解析且能侦测两点间空间上的最短距离，位置则由粒子的不同光学特性定位(拓墣解析)。在合适的条件下，则是依定位的精确度, 粒子密度等等决定，"拓墣解析"则是对应"空间频率"。

SPDM 是一种定位显微镜能达到有效的光学解析较于传统的光学解析(大概200-250 nm)更佳，能显出有效点像函数的最大值的一半宽，借由应用合适的雷射光学精密处理技术，位置与距离小于点分散函数(传统上200-250 nm) 的一半宽，且能被侦测目标物与不同的光学讯号精确到纳米等级。其中一项重要的应用是在基因研究方面(研究基因体中有功能的部分)，另一项则是研究膜的构造。

定位光学显微镜的其中一个里程碑是1996年第一次在3D纳米等级上定位荧光物质，也因此从理论上与实验上证明定位的精确度。

                               
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单一的YFP分子在超解析显微镜下的图/ SPDMphymod

SPDMphymod: GFP快门模式标准萤光染剂(Standard fluorescent dyes in the blinking mode like GFP)

在过去两年有分子应用在纳米显微研究，此分子能射出一样光谱频率的光(但在光学的闪光特性上则不同)且能像光学间距精密显微镜一样借由光来调控能否射出光。能借由结合上千张相同细胞的影像且使用雷射光谱精密测量来记录定位的影像达到改善光学分辨率。应用这种特别的纳米显微处理技术在过去是非常困难的，因为过去以为只有特殊制造的分子才能使用光来调控能否射出光。

在2008年3月，克里斯托夫克勒梅的实验室发现在某种光学-物理条件下也可以使用许多标准萤光染剂GFP、Alexa染剂与萤光素分子，使用SPDMphymod (可物理修饰萤光团physically modifiable fluorophores)技术，在适合的光强度下，单一雷射则可以显出纳米级的影像。与其他需要两条雷射的定位显微镜不同，使用特别的光-调控/光-活化荧光分子。

GFP基因很早就被引进而且表现在许多原核与真核生物中，由于他们发现与开发GFP ，诺贝尔奖 化学奖在2008年颁发给en:Martin Chalfie、en:Osamu Shimomura与 en:Roger Y. Tsien。标准荧光分子除了能应用在SPMD上，还能应用在许多其他的领域上像是生理学, 细胞生物学与医学等等。

SPDMphymod科技已经能使用标准荧光染剂:GFP, RFP, YFP, Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647, Cy2, Cy3, Atto 488与萤光素。

                               
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双重颜色定位显微镜SPDMphymod/使用GFP与RFP结合蛋白的超解析光学显微镜图

纳米等级光学显微镜(LIMON): 3D超解析显微镜

纳米等级光学显微镜(LIMON Light MicrOscopical nanosizing microscopy) 在2001年海德堡大学发明，同时结合定位显微镜与空间调整照明设备在3D超解析显微镜上。

结合SMI与SPDM使垂直显像SMI能绘出3D图像，因此第一次SMI计划与SPDM计划始动。SMI计划决定粒子的中心与粒子的在显微镜轴的分散方向。然而粒子或分子的中心可以精确到1-2 nm，分散离中心的程度可以被由轴直径精确到30-40 nm。

随后，侧向粒子或分子则采用SPDM来定位且能精确到纳米等级。SPDM能达到每秒16桢与有效的2D分辨率精确到10 nm ;大概每2000帧能与SMI资料结合(所需时间大约10秒)而产生高分辨率的三维影像(有效的3D光学分辨率大概在40-50 nm左右)。而使用快速照相机有些甚至能有较快的速率(达到每秒数百桢)。而使用合适的染剂能产生较好的3D解析影像。

应用SPDMphymod结合SMI (两者都在1996年由克里斯托夫克勒梅的实验室所发明) 利用3D双重颜色重建Her2/neu与 Her3的排列模式，这些蛋白团能被定位精确到25 nm。

工业上使用超解析显微镜

超解析显微技术既能使用在生医实验室还能应用在制药研究上，在辨识与判断目标物的价值上特别有用，例如: 生物分子装置(BBM biomolecular machines) 都是由许多胜任基本功能的体细胞大分子所组成高度纳米结构的复合物，依功能而决定特定的结构，BBM的其中一个例子是拟核区，它让两米长的DNA折叠在直径只有几微米的区域，因此DNA 才能在细胞中扮演讯息与调控的中心脚色。

借由使用LIMON 3D结合LIMON复合物标定，使第一次做3D复合物如BMM的隐密蛋白质或核酸能显像且不破坏其结构。直到现今，最大的问题是在详细分析内部大分子时必须破坏复合物的构造，所以有些利用电脑模型或者以核磁共振方式来模拟复合物的三维结构。